Nel territorio ostunese esistono testimonianze della presenza di insediamenti umani risalenti al paleolitico e al neolitico. Fra di esse la più importante di tutte è lo scheletro di una donna incinta (detta "Delia") ritrovato in contrada Agnano e datato 25.000 anni fa. Di eccezionale rilievo artistico e storico sono anche le specchie e i dolmen, i monumenti lasciatici dalle popolazioni preistoriche che avevano colonizzato la fascia costiera, ai piedi di Ostuni (tra Savelletri e Villanova).
Ostuni fu centro della civiltà messapica. Di questa affascinante civiltà ci restano ancora tracce, oltre che nei resti della prima cinta muraria (sec. IV a. C.), nei reperti archeologici della zona dei giardini (iscrizioni, monete, bronzi, vasi) e in chiese rupestri e grotte. In seguito, la "Città bianca" fu dominata dai romani e dai longobardi, ma di questo periodo storico ci restano purtroppo scarse testimonianze.
Divenuta sede vescovile (876) e città fortificata, Ostuni assimilò rapidamente i dettami dell'arte bizantina cui è ispirata l'architettura cittadina, specie quella di carattere religioso (si vedano le pitture rupestri della Madonna della Nova del sec. XIV e il portale della parrocchia dello Spirito Santo del 1600).
Sotto la dominazione normanna (sec. XI-XIII) vennero emanate norme relative al sistema di reggimento cittadino e fu edificato un castello di forma triangolare munito di tre torri: queste torri, effigiate nello stemma di Ostuni, assurgeranno a simbolo della "Città bianca".
Con le crociate Ostuni ed il suo porto Petrolla (odierna Villanova) conoscono un periodo di particolare sviluppo.
Gli anni della dominazione angioina segnano per Ostuni la sanzione di città di regio demanio, finché, nel 1420, viene ceduta a Giovanni Antonio del Balzo Orsini, principe di Taranto.
Durante la dominazione aragonese la città vive un periodo di particolare floridezza economica e di vivacità culturale e, sempre in questi anni, viene ampliato il borgo ed edificata la Cattedrale e vengono rafforzate le mura già erette in epoca angioina.
Particolarmente intenso è il conflitto che oppone il patriziato cittadino al feudatario per tutto il periodo spagnolo, finché, dopo la guerra dei trent'anni, Ostuni verrà venduta (1639) da Filippo IV al mercante Giovanni Zevallos. Questi,nominato solo qualche anno dopo duca, con le sue continue usurpazioni, finirà col mettere in ginocchio la popolazione e col condannare al declino la città intera. Sarà soltanto sotto il dominio austriaco che Ostuni riuscirà a liberarsi degli Zevallos che vennero condannati a restituire tutti i beni usurpati. Forse proprio a causa delle secolari liti che avevano contrapposto i cittadini ai feudatari, Ostuni sarà tra le prime "università" del Regno di Napoli retto dai Borbone a compilare il catasto onciario.
Restaurati i Borbone sul trono napoletano, all'indomani del cosiddetto decennio francese (1806-1815), la "Città bianca" diverrà un'importante centro di opposizione antigovernativa e d'irradiamento della carboneria prima e della Giovine Italia poi, partecipando attivamente ai moti del '20 e del '48, fino ad essere la prima città pugliese a far sventolare il vessillo dell'Italia unita.